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PCR體系及各類常見PCR辨析

更新時間:2023-11-06點擊次數:844

聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction)簡稱PCR,是一種體外高效擴增特定DNA片段的分子生物學技術。該技術的發明人是Kary Mullis,他從1983年開始研究PCR技術,1985年開始被逐漸采用,成為分子生物學的一項常規手段,并得到了廣泛的應用,在臨床診斷、生物醫學研究和法醫學領域都具有重要意義。PCR是在體外模擬體內DNA復制的過程,它用加熱的辦法讓需要擴增的DNA片段變性解鏈成兩條單鏈,人工合成的一對引物讓它們結合到DNA模板(分別結合到兩條鏈上)的兩端,DNA聚合酶即可以大量復制該模板。了解了PCR的基本過程,再一起來學習一下PCR體系及各類常見PCR辨析吧!

PCR體系

1. 模板

需要研究或擴增的目的核酸分子,DNA可以直接擴增,RNA需要增加一步逆轉錄,或者在體系中加逆轉錄酶一步法進行RT-PCR擴增;

2. 引物

良好設計的引物,是擴增特異性及擴增效率的關鍵因素之一;

3. Taqase

PCR體系的核心組分,Taqase的性能,直接決定了擴增體系能否達到實驗要求;

針對不同類型的模板、特異性的要求、產物保真度的要求、擴增產物的長度,需要選用能滿足對應要求的Taqase;所選用的酶如果不匹配,實驗是無法成功的;

對一株Taqase的性能評價,主要是如下幾個方面:擴增效率,擴增速度,保真度,除了催化鏈延伸之外的其它活性,抗逆性等;

4. dNTP

dNTP的濃度和質量,也是影響擴增產率的一個重要因素;dNTP分子中,含有一個高能磷酸鍵,是影響dNTP穩定性的關鍵因素,高能磷酸鍵的斷裂也是造成dNTP質量不合格的分子層面的原因;

5. Buffer

為PCR反應體系提供穩定的工作環境,主要環境因素為pH值,離子強度等;

6. Mg++

因為鎂離子對Taqase活性影響大,所以一般buffer之外,還單獨帶一管Mg++,方便用戶靈活調節體系里面Mg++濃度;

除了上述六種必要的組分之外,還有較多的工具蛋白或者小分子化合物,能對PCR體系起到相應的作用,這方面累積的研究成果也比較多。

各類常見PCR辨析

1. PCR,通常指的是普通PCR,以雙鏈DNA為模板,以dNTP為底物,大量(30個循環理論上可以使產物增加到模板初始摩爾數的10的9次方倍)擴增雙鏈DNA。產物通常以電泳及凝膠成像方式來分析。

2. qPCR和Real-time PCR,指的是實時熒光定量PCR,以DNA或cDNA為模板,以dNTP為底物,以熒光基團為報告分子,收集熒光信號從而對擴增出的DNA進行定量分析。為避免和RT-PCR(逆轉錄PCR)混淆,現在一般不太常用real-time PCR,通常交流,用qPCR指代更明確。

3. RT-PCR,指的是逆轉錄PCR,以由mRNA逆轉錄成的cDNA為模板,以dNTP為底物,進行DNA的擴增及檢測。

4. RT-qPCR,指的是實時熒光定量逆轉錄PCR,是qPCR+RT-PCR的組合,將總RNA或mRNA逆轉錄成cDNA后再作為模板,以dNTP為底物,進行產物的定量分析。

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