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Polysciences 24765-1轉染試劑——用于貼壁細胞的轉染流程

更新時間:2025-03-10點擊次數:86

操作方法: 6 孔板轉染 293T 細胞為例
(初次使用 PEI 進行不同基因轉染時應先做預試,優化出適合自己實驗的最 佳 PEI DNA 的比例。)

轉染前準備:

1. 轉染前一天:用膠原酶消化細胞并計數(不建議用胰酶)。按照每孔2x106的細胞量接種 293T6孔板(每孔加入2ml新鮮的 DMEM:F12+5%FBS wan全培養基和1ml的細胞懸液)置于 37°C5%C02,培養箱培養24h

2. 24h后,移除之前培養基,每孔加入2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS
注意:確保 293T 細胞生長狀態良好傳代不超過 15 代。

轉染流程:
1. 第一天: 顯微鏡下檢查細胞匯合度,當細胞達到 70%80%的匯合度時,開始準備轉染。
2. 對于每孔細胞,用 100μL無血清培養基(如 OPTI-MEMI培養基)稀釋 DNA 使 DNA 終濃度為 1ug/mlDNA/總培養體積)。

3. 對于每孔細胞,用 100μL無血清培養基(OPTI-MEM I培養基)稀釋適當比例的適量24765-1DNA:PEI的比例要依據自己實驗摸索最適比例。
4. 將稀釋的 24765-1轉染試劑加入到稀釋的質粒中(總體積 200μL)輕輕混勻,室溫孵育 30 分鐘。

4. 小心地將 PEI-DNA 復合物滴加到細胞培養板每個孔中,輕輕搖動培養板混勻。注意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入,而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。
6. 將培養板放入 37°C5%C02,培養箱培養中培養 24h

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觀察結果:
第二天,在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率,通常超過 80%293T 細胞在轉染后的 24h可以觀察到綠色熒光。

注意:
 建議進行不同基因轉染時應對 PEI DNA 的比例進行優化,以達到最適比例,通常 篩選范圍在 1:1 5:1 之間。

通常情況下,分別準備 PEI DNA 轉染溶液時其體積一般是轉染前每孔細胞培養液 體積總量的 1/10-1/20,如細胞培養液體積為 3ml,則稀釋 PEI DNA 的體積為 150ul 。質粒 DNA 的濃度通常為 1ug/mlDNA 質量/細胞培養總體積)。

不同質粒種類以及大小會影響轉染效率,如較大片段插入質粒可能轉染效率低,可根據 實際實驗需要調整,如適當增加轉染質粒總量等。

 HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反復吹打,但 CHO-S 細胞的粘附性比較強,重懸浮時需要借助細胞刮刀。

一般建議用膠原酶消化細胞,如果表達的是膜蛋白,胰酶消化細胞可能會降低蛋白表達, 建議用膠原酶消化細胞。
對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養皿之間的粘附性。

 一旦確定了細胞類型、培養基和 PEI DNA 的最佳比例,就可以在轉染后 24 96 小時內多次觀察轉染效率,以優化最大表達量時間點。

 

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