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直擴PCR技術的使用場景及常見問題

更新時間:2023-12-01點擊次數:1316

直擴/直接PCR——Direct PCR,一種不需要額外提取DNA就能夠實現體外DNA擴增的技術,省去提取基因組DNA的繁瑣程序,可以直接應用于PCR的快速檢測。直擴PCR最早應用的領域是動植物領域,比如鼠、貓、雞、兔、羊、牛等動物的血液、組織和毛發;植物的葉片和種子等,用來研究基因分型、轉基因、質粒檢測、基因敲除分析、DNA來源鑒定、物種鑒定、SNP分析等領域。

這些領域有一些共同的特點,那就是目標基因的含量比較高,核酸提取麻煩,所以直擴PCR不僅能夠節省時間,對結果的影響很小,同時也能節省成本。本文就一起來了解一下直擴PCR技術的使用場景及常見問題。

在做分子實驗時,什么情況下建議使用直擴PCR而不是常規PCR呢?

1.只需要提取樣品基因組DNA進行PCR、分子克隆等實驗,不需要長期保存DNA。如基因型鑒定、CRISPR-Cas9陽性鑒定等;

2.樣品量較大時,做PCR鑒定需要保存陽性樣本基因組DNA,也可使用Direct PCR進行樣本初步篩選,有利于節約時間、成本;

3.樣本量較少,無法使用基因組提取試劑盒提取的樣品也可嘗試此方法。

直擴PCR常見問題與解決辦法

Q1:擴增無目的條帶?

A1:

1) 樣品

a.裂解樣品過多。建議按照說明書取樣進行裂解;

b.樣品中抑制成分濃度過高。釋樣品后再取適量作為模板。

2) 引物

a.引物設計不合理;

b.引物降解;

建議用提取的DNA樣品作為對照,用試劑盒陽性引物對照進行試驗,重新設計引物。

3)  程序:

a.PCR擴增程序不合適。調整PCR程序(優化退火溫度:使用降落PCR,梯度PCR,增加循環數至35~40個循環、延伸時間增加等)。


Q2:擴增出現非特異條帶

A2:

1) 引物:

a.引物設計不合理。重新設計引物(從引物5’端延長引物至25~30bp,Tm值65~67℃);

b.引物濃度過高。降低引物濃度。

2)樣品

a.裂解樣品過多。建議按照說明書取樣進行裂解;

b.樣品中抑制成分濃度過高。釋樣品后再取適量作為模板。

3)  程序:

a.退火。優化退火溫度,使用降落PCR,梯度PCR;

b.延伸。減少延伸時間;

c循環數。降低循環數。

本期內容:直擴PCR技術的使用場景及常見問題

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